转录因子研究套路三

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在先前的推文中，小远发现大家对转录因子相关的文章比较感兴趣，因此猜测应该很多人都在做这方面的研究，为了更好的帮助大家开展转录因子的研究，本次推文主要是和大家一起来复盘一下转录因子的常规研究思路及方法，内容可以归纳为如下：

在正式阅读之前我们先来回顾一下转录因子的相关概念，转录因子（Transcriptionfactor，TF）也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。转录因子一般由DNA结合域、转录调控域（包括激活域或抑制域）、寡聚化位点以及核定位信号等4个功能区域组成。TF在植物生长发育和逆境防御反应等过程中具有重要调控作用，因此，对TF及其相互作用因子的功能研究对了解它们在信号级联反应中的作用至关重要。

转录因子筛选及分析

在进行转录因子的研究时，我们首先需要通过实验筛选目标转录因子，常用的方法有转录组测序（RNA-seq）、ATAC-seq、酵母单杂筛库等。在方法的选择上：（1）如果现有的研究基础较少且没有靶基因，可以选择用RNA-seq或ATAC-seq，当然也可以两种方法联合使用。RNA-seq是从整体组织或细胞的转录水平，系统研究基因的转录图谱，其测定的数据中除了转录因子的表达信息外，还有其它基因的测定结果；ATAC-seq则是在全基因组范围内检测染色质的开放程度，得到全基因组范围内蛋白质可能结合的位点信息，从而筛选感兴趣的特定转录因子（在实际应用中ATAC-seq通常会与其他测序如RNA-seq、ChIP-seq等，一起联用进行组合分析）。（2）如果现有的研究基础已经较为丰富，想通过靶基因筛选上游调控因子，那么就可以用现有基因的启动子序列通过酵母单杂筛库的方法来寻找与之结合的转录因子。筛选到候选的转录因子之后我们还可以利用生物信息学对其进行分析。尤其是在某些物种基因组注释没有那么透彻的情况下，对研究物种中某个转录因子家族基因进行全局鉴定也可以做为研究的方向。

1.1转录组测序

转录组测序是对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序，既可以提供定量分析，检测基因表达水平差异，又可以提供结构分析，发现稀有转录本，精确地识别可变剪切位点、基因融合等。目前，RNA测序（RNAsequencing，RNA-Seq）技术已成为了转录组学研究的重要手段之一。

在“ComparativeTranscriptomeAnalysisoftheClimactericofApplefruitUncoverstheInvolvementoftranscriptionfactorsaffectingethylenebiosynthesis”一文中，作者为了鉴定苹果果实贮藏过程中差异表达的转录因子，明确它们调控苹果果实贮藏过程中乙烯合成的模式。作者首先通过对跃变前（0-Pre），跃变后（15-Post）和1-甲基环丙烯（15-MCP）处理的苹果果实进行转录组测序分析（图1），从中鉴定到了多种差异表达的转录因子，包括MdAGL30、MdAGL、MdERF、MdNAC71、MdDof1.2、MdHSFB2a和MdHSFB3。接着通过Y1H、GUS报告基因和LUC报告基因以及苹果愈伤组织转基因等试验明确了筛选出的转录因子在果实乙烯合成中的调控作用。

图1RNA-Seq筛选到的乙烯生物合成和信号转导相关差异基因相对表达的热图(Lietal.,)。

1.2ATAC-seq

ATAC-Seq技术是一种研究表观遗传的创新型技术，它是一种在全基因组水平上通过高度活跃的Tn5转座酶切割DNA序列来检测染色质可及性的方法。通俗地讲，就是Tn5转座酶可以随机结合并切割染色质开放区的DNA，并且可同时在切割位点插入接头序列。只要将携带已知DNA序列标签的转座复合物加入到细胞核中一起孵育，再利用已知序列标签进行PCR扩增即可建成文库，经过测序就可以获得染色质开放区的信息了（图2）。ATAC所捕获的染色质开放区一般是正在转录的那部分DNA序列的上下游，得到这些序列我们就可以对富集到的序列结合motif分析，识别哪种转录因子参与了基因表达调控，通过ATAC-seq寻找出来的转录因子一般是全基因组内发挥关键作用的调控因子。除此之外，ATAC-seq在核小体定位、识别启动子区域、潜在的增强子或沉默子、绘制染色质开放图谱、寻找转录因子调控的靶基因等方面都具有广泛的应用。有关ATAC-seq的详细介绍，大家感兴趣的话可以查阅小远的往期文章“解析表观遗传学的工具——ATAC-seq（一）”。

图2ATAC-seq转座反应和文库制备示意图(Grandietal.,)。（a）将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即带红色和蓝色序列标签的Tn5转座酶）加入到细胞核中一起孵育；（b）再利用引物进行PCR扩增即可形成文库。（c）经过测序和分析就可以获得染色质开放区的信息。

在“ATAC-seqandRNA-seqrevealtheroleofAGL18inregulatingfruitripeningviaethylene-auxincrosstalkinpapaya”一文中，作者使用ATAC-seq和RNA-seq联合分析的方法，揭示了在木瓜成熟过程中用1-甲基环丙烯（1-MCP）处理后不同时间的染色质可及性的差异，并挖掘出了在1-MCP处理下影响果实成熟的关键转录因子以及靶标基因。在研究过程中，作者首先使用ATAC-seq发现MADS转录因子参与木瓜果实成熟。接着通过ATAC-seq和RNA-seq联合分析的方法发现，CpAGL18（MADS）和生长素信号通路（CpWAT、CpSAUR32/50、CpPIN、CpTIR1）以及乙烯信号通路（CpEIL3、CpERF和CpACS1）的相关基因在木瓜果实成熟过程中可能具有重要作用，整合ATAC-seq和RNA-seq的基因组可视化图谱表明CpAGL18和CpSAUR32以及CpACS1在1-MCP的不同处理下其表达量和关联染色质的开放性发生变化（图3）。最后，作者结合体内、体外实验证实了CpAGL18可以结合并激活CpACS1和CpSAUR32的表达，从而参与乙烯和生长素信号通路，进而影响木瓜果实的成熟。

图3整合ATAC-seq和RNA-seq的基因组可视化图谱显示受1-MCP影响的基因表达差异以及这些基因关联的染色质的可及性变化(Caietal.,)。红色和蓝色表示基因的表达差异，绿色和紫色表示基因关联的染色质可及性变化。

1.3酵母单杂筛库

酵母单杂交是将DNA顺式作用元件作为诱饵，筛选靶元件特异结合的转录因子（cDNA）的有效方法。其原理是将包含感兴趣的DNA（通常被称为诱饵（Bait））和报告基因融合的诱饵载体，与包含感兴趣的转录因子（TF，通常被称为猎物（Prey））和酵母转录激活域（AD）融合的猎物载体都转入到合适的酵母菌株中，如果TF在酵母细胞核的环境中与Bait结合，那么AD就会诱导报告蛋白的表达。需要注意的是以文库的形式进行酵母单杂筛选后，其中阳性菌落必须进行测序和回转验证（图4）。

图4Y1H分析的变化和注意事项概述(SewellJaredA.andJuanI.FuxmanBass,)。利用限制性内切酶（RE）或Gateway技术将复杂调控区、转录因子结合基序或非编码变异的DNA序列克隆至报告基因上游。这些结构最常被整合至酵母基因组中以产生DNA诱饵菌株。然后将DNA诱饵菌株转化或与一组猎物克隆（ORF融合到Gal4的激活结构域AD上）Mating。编码猎物的载体可以是低拷贝或高拷贝的。筛选除了以文库进行筛选外，也可以以阵列的形式进行筛选，阳性菌落的位置表明相互作用的转录因子（TF）的信息。

在“Constructionofyeastone-hybridlibraryandscreeningoftranscriptionfactorsregulatingLhMYBSPLATTERexpressioninAsiatichybridlilies(Liliumspp.)”一文中，作者为了研究LhMYBSPLATTER直接相关调控蛋白在花青素色素沉着中的分子机制，构建了酵母单杂交（Y1H）cDNA文库。通过重组诱饵质粒筛选出了7种猎物蛋白（候选转录因子），分别为BTF3、MYB4、IAA6-like、ERF4、ARR1、ERFWIN1-like和ERF。之后作者验证转录因子与LHMYBsplater启动子的相互作用时发现，ERFs、AUX/IAA和BTF3可能参与百合花青素生物合成途径的负调控。

表1转录因子筛选结果(Caoetal.,)。

1.4生物信息学分析

大多数转录因子的序列具有保守性，这些保守结构域使得用生物信息学方法进行转录因子的分析成为可能。DNA结合结构域（BD）是转录因子最主要的保守区域，其次还有转录激活域（AD）或转录抑制域（RD），在漫长的进化过程中，这些区域的氨基酸序列变化都很小，确保了转录因子功能的准确行使。利用生物信息学分析可以快速分析筛选到的转录因子的核心区域、信号肽、蛋白的糖基化位点、磷酸化位点、蛋白激酶结合位点和蛋白亲/疏水性等，在此为大家简单列举一些常用的网站（具体使用方法大家可以查阅相关的网址使用介绍，小远在此就不再展开讲解了）：

（1）蛋白功能结构域预测：MEME（